14.4 Eftirmyndun DNA í dreifkjörnungum

DNA-eftirmyndun notar fjölda stoðpróteina og ensíma sem hvert gegnir mikilvægu hlutverki í ferlinu. Einn lykilþátturinn er ensímið DNA-pólýmerasi, einnig kallað DNA pol, sem bætir kirnum einu af öðru við vaxandi DNA-keðju sem er samstæð mótstrengnum. Viðbót kirna krefst orku; hún fæst úr núkleósíðþrífosfötunum dATP, dGTP, dTTP og dCTP. Líkt og ATP eru hin NTP-efnin (núkleósíðþrífosfötin) orkuríkar sameindir sem geta bæði verið uppspretta DNA-kirna og orkugjafi fyrir fjölliðunina. Þegar tengið milli fosfatanna er rofið er orkan sem losnar notuð til að mynda fosfódíestertengi milli kirnisins sem bætist við og vaxandi keðjunnar. Í dreifkjörnungum eru þrjár megingerðir pólýmerasa þekktar: DNA pol I, DNA pol II og DNA pol III. Nú er vitað að DNA pol III er ensímið sem þarf til DNA-nýmyndunar; DNA pol I er mikilvægt hjálparensím í DNA-eftirmyndun og ásamt DNA pol II er það fyrst og fremst nauðsynlegt fyrir viðgerðir.

DNA-pólýmerasi hefur tvær mikilvægar takmarkanir: hann getur aðeins bætt kirnum við í 5′ til 3′ stefnu, þannig að nýr DNA-þráður getur aðeins lengst í þessa stefnu. Hann þarf einnig lausan 3′-OH-hóp sem hann getur bætt kirnum við með því að mynda fosfódíestertengi milli 3′-OH-endans og 5′-fosfats næsta kirnis. Þetta þýðir í raun að hann getur ekki bætt við kirnum ef laus 3′-OH-hópur er ekki til staðar. Hvernig bætir hann þá við fyrsta kirninu? Vandamálið er leyst með hjálp vísis sem veitir lausan 3′-OH-enda. Annað ensím, RNA-prímasi, nýmyndar RNA-bút sem er um fimm til tíu kirni að lengd og samstæður DNA-mótinu. Þar sem þessi röð undirbýr DNA-nýmyndunina kallast hún vísir. DNA-pólýmerasi getur nú lengt RNA-vísinn og bætt við kirnum einu af öðru sem eru samstæð mótstrengnum (mynd 14.14).

Eftirmyndunarkvíslin hreyfist um 1000 kirni á sekúndu. Tópóísómerasi kemur í veg fyrir ofvindingu DNA-tvöfalda gormsins framan við eftirmyndunarkvíslina þegar DNA er að opnast; hann gerir það með því að valda tímabundnum rofum í DNA-gorminum og loka honum síðan aftur. Þar sem DNA-pólýmerasi getur aðeins lengt í 5′ til 3′ stefnu og DNA-tvöfaldi gormurinn er andsamsíða skapast smávægilegt vandamál við eftirmyndunarkvíslina. Mótstrengirnir tveir hafa gagnstæða stefnu: annar er í 5′ til 3′ stefnu og hinn í 3′ til 5′ stefnu. Aðeins einn nýr DNA-þráður, sá sem er samstæður 3′ til 5′ foreldrastrengnum, getur verið nýmyndaður samfellt í átt að eftirmyndunarkvíslinni. Þessi samfellt nýmyndaði þráður kallast leiðandi strengur. Hinn þráðurinn, sem er samstæður 5′ til 3′ foreldrastrengnum, er lengdur frá eftirmyndunarkvíslinni í litlum bútum sem kallast Okazaki-bútar, og hver þeirra þarf vísi til að hefja nýmyndunina. Nýir vísisbútar eru lagðir niður í átt að eftirmyndunarkvíslinni, en hver þeirra vísar frá henni. Okazaki-bútar eru nefndir eftir japanska vísindamanninum sem uppgötvaði þá fyrst. Strengurinn með Okazaki-bútunum kallast seinni strengur.

Leiðandi strengurinn getur lengst út frá einum vísi, en seinni strengurinn þarf nýjan vísi fyrir hvern stuttan Okazaki-bút. Heildarstefna seinni strengsins verður 3′ til 5′ og stefna leiðandi strengsins 5′ til 3′. Prótein sem kallast renniklemma heldur DNA-pólýmerasanum á sínum stað á meðan hann heldur áfram að bæta við kirnum. Renniklemman er hringlaga prótein sem binst DNA og heldur pólýmerasanum á sínum stað. Eftir því sem nýmyndun heldur áfram er RNA-vísum skipt út fyrir DNA. Vísarnir eru fjarlægðir með útkirnaskeravirkni DNA pol I, sem notar DNA fyrir aftan RNA sem sinn eigin vísi og fyllir í eyðurnar sem myndast þegar RNA-kirnin eru fjarlægð með því að bæta við DNA-kirnum. Rofin sem eftir standa milli nýmyndaðs DNA, sem kom í stað RNA-vísisins, og áður nýmyndaðs DNA eru innsigluð af ensíminu DNA-lígasa, sem hvatar myndun fosfódíestertengja milli 3′-OH-enda eins kirnis og 5′-fosfatenda hins bútarins.

Þegar litningurinn hefur verið fullkomlega eftirmyndaður færast DNA-afritin tvö í tvær mismunandi frumur við frumuskiptingu.

Ferli DNA-eftirmyndunar má draga saman á eftirfarandi hátt:

1. DNA opnast við upphafsstað eftirmyndunar.
2. Helíkasi opnar DNA og myndar eftirmyndunarkvíslar sem lengjast í báðar áttir.
3. Einþátta bindiprótein þekja DNA í kringum eftirmyndunarkvíslina til að koma í veg fyrir að það vindist aftur upp.
4. Tópóísómerasi binst svæðinu framan við eftirmyndunarkvíslina til að koma í veg fyrir ofvindingu.
5. Prímasi nýmyndar RNA-vísa sem eru samstæðir DNA-mótstrengnum.
6. DNA-pólýmerasi III byrjar að bæta kirnum við 3′-OH-enda vísisins.
7. Lenging bæði seinni strengsins og leiðandi strengsins heldur áfram.
8. RNA-vísar eru fjarlægðir með útkirnaskeravirkni.
9. DNA pol I fyllir eyðurnar með því að bæta við dNTP-efnum.
10. Bil milli DNA-búta eru tengd saman af DNA-lígasa, sem hjálpar til við myndun fosfódíestertengja.

Tafla 14.1 tekur saman ensímin sem koma að DNA-eftirmyndun dreifkjörnunga og hlutverk hvers þeirra.