1717 Líftækni og erfðamengjafræði

17.3 Raðgreining heilla erfðamengja

Námsmarkmið

Í lok þessa hluta muntu geta gert eftirfarandi:

Lýst þremur gerðum raðgreiningar
Skilgreint raðgreiningu heilla erfðamengja

Þótt verulegar framfarir hafi orðið í læknavísindum á undanförnum árum, standa læknar enn ráðþrota gagnvart sumum sjúkdómum og nota þeir raðgreiningu heilla erfðamengja til að finna rót vandans. Raðgreining heilla erfðamengja er ferli sem ákvarðar DNA-röð heils erfðamengis. Raðgreining heilla erfðamengja er víðtæk nálgun til að leysa vandamál þegar erfðafræðilegur grunnur liggur til grundvallar sjúkdómi. Nokkrar rannsóknarstofur veita nú þjónustu við að raðgreina, greina og túlka heil erfðamengi.

Til dæmis er útraðaraðgreining ódýrari valkostur en raðgreining heilla erfðamengja. Í útraðaraðgreiningu raðgreinir læknirinn aðeins kóðandi, útraðasvæði DNA. Árið 2010 notuðu læknar útraðaraðgreiningu til að bjarga ungum dreng sem var með margar dularfullar ígerðir í þörmum. Barnið hafði gengist undir nokkrar ristilaðgerðir án þess að fá bót meina sinna. Að lokum framkvæmdu þeir útraðaraðgreiningu, sem leiddi í ljós galla í ferli sem stjórnar stýrðum frumudauða. Læknarnir notuðu beinmergsígræðslu til að sigrast á þessum erfðagalla, sem leiddi til lækninga fyrir drenginn. Hann var fyrsta manneskjan til að fá árangursríka meðferð sem byggðist á greiningu með útraðaraðgreiningu. Í dag er raðgreining á erfðamengi mannsins aðgengilegri og niðurstöður fást innan tveggja daga fyrir um 1000 Bandaríkjadali.

Aðferðir í raðgreiningarverkefnum

Grunnaðferðin við raðgreiningu sem notuð er í öllum nútíma raðgreiningarverkefnum er keðjustöðvunaraðferðin (einnig þekkt sem dídeoxý-aðferðin), sem Fred Sanger þróaði á áttunda áratugnum. Keðjustöðvunaraðferðin felur í sér DNA-eftirmyndun á einþátta móti með því að nota vísi og venjuleg deoxýkirni (dNTP), sem eru einliðir, eða einstakar DNA-einingar. Vísinum og dNTP-kirnum er blandað saman við lítið hlutfall af flúrljómunarmerktum dídeoxýkirnum (ddNTP). ddNTP eru einliðir sem vantar hýdroxýlhóp (-OH) á staðnum þar sem annað kirni tengist venjulega til að mynda keðju (Mynd 17.13). Vísindamenn merkja hvert ddNTP með mismunandi lit af flúrljómandi litarefni. Í hvert skipti sem ddNTP innlimast í vaxandi samstæðan DNA-streng, stöðvar það DNA-eftirmyndunarferlið, sem leiðir til margra stuttra strengja af eftirmynduðu DNA sem enda hver á mismunandi stað í eftirmynduninni. Þegar hvarfblöndunni er skipt upp í einþætti og hún keyrð í rafdrætti, mynda hinir mörgu nýeftirmynduðu DNA-strengir stiga vegna mismunandi stærða. Vegna þess að ddNTP eru flúrljómunarmerkt, endurspeglar hvert band í gelinu stærð DNA-strengsins og það ddNTP sem stöðvaði hvarfið. Mismunandi litir flúrljómunarmerktu ddNTP-anna hjálpa til við að bera kennsl á það ddNTP sem innlimaðist á þeim stað. Með því að lesa gelið út frá lit hvers bands í stiganum fæst röð mótstrengsins (Mynd 17.14).

A deoxynucleotide consists of a deoxyribose sugar, a base, and three phosphate groups. Dideoxyribose is identical to deoxyribose except that the hydroxyl, upper case O upper case H, group at the 3 prime position is replaced by upper case H. A 3 prime hydroxyl is necessary for elongation of the D N A chain, and the chain therefore stops growing if a dideoxyribose instead of deoxyribose is incorporated into the growing chain. — **Mynd 17.13.** Dídeoxýkirni er svipað að byggingu og deoxýkirni, en vantar 3′-hýdroxýlhópinn (sýnt með kassanum). Þegar dídeoxýkirni er innlimað í DNA-streng, stöðvast DNA-nýmyndun.

The left part of this illustration shows a parent strand of D N A with the sequence G A T T C A G C, and four daughter strands, each of which was made in the presence of a different dideoxynucleotide: lower case d lower case d upper case A upper case T upper case P, and lower case d lower case d upper case C upper case T upper case P, and lower d lower d upper G upper T upper P, or lower d lower d upper T upper T upper P. The growing chain terminates when a lower d lower d upper N T P is incorporated, resulting in daughter strands of different lengths. The right part of this image shows the separation of the D N A fragments on the basis of size. Each lower d lower d upper N T P is fluorescently labeled with a different color so that the sequence can be read by the size of each fragment and its color. — **Mynd 17.14.** Þessi mynd sýnir dídeoxý-keðjustöðvunaraðferð Frederick Sanger. Með því að nota dídeoxýkirni getur DNA-búturinn endað á mismunandi stöðum. DNA-bútar aðskiljast á grundvelli stærðar og við getum lesið þessi bönd út frá stærð bútanna.

Snemmbúnar aðferðir: Haglabyssuraðgreining og pöruð endaraðgreining

Í haglabyssuraðgreiningu er mörgum eintökum af DNA-bútum skipt af handahófi í marga smærri búta (svipað og gerist við haglabyssuskot þegar hleypt er af haglabyssu). Allir bútarnir eru raðgreindir með keðjustöðvunaraðferðinni. Síðan, með tölvuaðstoð, geta vísindamenn greint bútana til að sjá hvar raðir þeirra skarast. Með því að para saman raðir sem skarast á enda hvers búts geta vísindamenn endurgert alla DNA-röðina. Stærri röð sem er sett saman úr styttri röðum sem skarast kallast samröð (contig). Sem samlíkingu má hugsa sér að einhver sé með fjögur eintök af landslagsljósmynd sem þú hefur aldrei séð áður og veist ekki hvernig á að líta út. Viðkomandi rífur síðan hverja ljósmynd í sundur með höndunum, þannig að mismunandi stórir bitar eru til staðar úr hverju eintaki. Viðkomandi blandar síðan öllum bitunum saman og biður þig um að endurskapa ljósmyndina. Á einum af minni bitunum sérðu fjall. Á stærri bita sérðu að sama fjall er bak við vatn. Þriðji búturinn sýnir aðeins vatnið, en hann leiðir í ljós að það er kofi á vatnsbakkanum. Því veistu, með því að skoða upplýsingarnar sem skarast í þessum þremur bútum, að myndin inniheldur fjall bak við vatn sem hefur kofa á bakkanum. Þetta er meginreglan á bak við endursköpun heilla DNA raða með haglabyssuraðgreiningu.

Upphaflega greindi haglabyssuraðgreining aðeins annan enda hvers búts með tilliti til skörunar. Þetta dugði til að raðgreina lítil erfðamengi. Hins vegar leiddi löngunin til að raðgreina stærri erfðamengi, eins og erfðamengi mannsins, til þróunar á tvíenda haglabyssuraðgreiningu, eða paraðri endaraðgreiningu. Í paraðri endaraðgreiningu greina vísindamenn enda hvers búts með tilliti til skörunar. Pöruð endaraðgreining er því þyngri í vöfum en haglabyssuraðgreining, en það er auðveldara að endurskapa röðina vegna þess að meiri upplýsingar eru tiltækar.

Næstu kynslóðar raðgreining

Frá árinu 2005 hafa sjálfvirkar raðgreiningaraðferðir sem rannsóknarstofur nota fallið undir regnhlífarhugtakið næstu kynslóðar raðgreining (NGS; djúpraðgreining eða stórfelld samhliða raðgreining), sem er hópur sjálfvirkra aðferða sem notaðar eru fyrir hraðvirka DNA-raðgreiningu. Þessir sjálfvirku, ódýru raðgreinar geta búið til raðir af hundruðum þúsunda eða milljónum stuttra búta (25-500 basapör) á einum degi. Þessir raðgreinar nota háþróaðan hugbúnað til að leysa það flókna verkefni að raða öllum bútunum í rétta röð.

Tengsl við þróun

Raðasamanburður

Raðasamanburður er röðun prótína, DNA eða RNA til samanburðar. Vísindamenn nota hann til að bera kennsl á svipuð svæði milli frumugerða eða tegunda, sem getur bent til varðveislu virkni eða byggingar. Við getum notað raðasamanburð til að smíða þróunartré. Eftirfarandi vefsíða notar hugbúnaðarforrit sem kallast BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

Undir „Web Blast“ skaltu smella á „Nucleotide Blast“. Sláðu eftirfarandi röð inn í stóra „query sequence“ kassann: ATTGCTTCGATTGCA. Fyrir neðan kassann skaltu finna reitinn „Organism“ og skrifa „human“ eða „Homo sapiens“. Smelltu síðan á „BLAST“ til að bera innsláttarröðina saman við þekktar raðir í erfðamengi mannsins. Leitin mun taka nokkurn tíma áður en niðurstöðurnar birtast. Niðurstaðan er sú að þessi röð kemur fyrir á yfir hundrað stöðum í erfðamengi mannsins. Listi yfir lýsingar á samsvörunum birtist. Smelltu á flipann „Graphic Summary“ fyrir ofan niðurstöðurnar og niðurstöðurnar verða sýndar með láréttum stikum og þú munt sjá stutta lýsingu á hverri samsvörun. Veldu eina af samsvörunum nálægt efsta hluta listans og smelltu á „alignment“, og í nýja glugganum smelltu á „Graphics“. Þetta mun færa þig á síðu sem sýnir staðsetningu raðarinnar innan alls erfðamengis mannsins. Þú getur fært sleðann sem lítur út eins og litaður fáni fram og til baka til að skoða raðirnar strax í kringum valið gen. Þú getur síðan farið aftur í valda röð með því að smella á „ATG“ hnappinn.

Notkun á heilum erfðamengjum líkanlífvera

Breski lífefnafræðingurinn og Nóbelsverðlaunahafinn Fred Sanger notaði bakteríuveiru, bakteríufaginn φX174 (5368 basapör), til að raðgreina fyrsta erfðamengið að fullu. Aðrir vísindamenn raðgreindu síðar nokkur önnur erfðamengi frumulíffæra og veira. Bandaríski líftæknifræðingurinn, lífefnafræðingurinn, erfðafræðingurinn og viðskiptamaðurinn Craig Venter raðgreindi bakteríuna Haemophilus influenzae á tíunda áratugnum. Um það bil 74 mismunandi rannsóknarstofur unnu saman að raðgreiningu erfðamengis gersins Saccharomyces cerevisiae, sem hófst árið 1989 og lauk árið 1996, en það var 60 sinnum stærra en nokkurt erfðamengi sem áður hafði verið raðgreint. Árið 1997 voru erfðamengjaraðir tveggja mikilvægra líkanlífvera aðgengilegar: bakteríunnar Escherichia coli K12 og gersins Saccharomyces cerevisiae. Við þekkjum nú erfðamengi annarra líkanlífvera, svo sem músarinnar Mus musculus, ávaxtaflugunnar Drosophila melanogaster, þráðormsins Caenorhabditis elegans og mannsins Homo sapiens. Rannsakendur framkvæma umfangsmiklar grunnrannsóknir á líkanlífverum vegna þess að þeir geta yfirfært upplýsingarnar á erfðafræðilega svipaðar lífverur. Líkanlífvera er tegund sem rannsakendur nota sem líkan til að skilja líffræðileg ferli í öðrum tegundum sem líkanlífveran er fulltrúi fyrir. Að hafa raðgreind heil erfðamengi hjálpar til við rannsóknarstarf í þessum líkanlífverum. Ferlið við að tengja líffræðilegar upplýsingar við genaraðir kallast erfðamengisskýring. Skýring genaraða hjálpar til við grunntilraunir í sameindalíffræði, svo sem hönnun á PCR-vísum og RNA-markröðum.

Tengill í námsefni

Smelltu þér í gegnum hvert skref raðgreiningar erfðamengis á þessu vefsvæði.

Notkunarmöguleikar erfðamengjaraða

DNA-örflögur eru aðferðir sem vísindamenn nota til að greina tjáningu gena með því að greina mismunandi DNA-búta sem eru festir á glerplötu eða kísilflögu til að bera kennsl á virk gen og raðir. Við getum uppgötvað næstum eina milljón arfgerðarfrávik með því að nota örflögur; en raðgreining heilla erfðamengja getur veitt upplýsingar um öll sex milljarða basapörin í erfðamengi mannsins. Þótt rannsóknir á raðgreiningu erfðamengja með læknisfræðilegum hagnýtingum séu áhugaverðar, þá beinist áherslan að óeðlilegri virkni gena. Þekking á öllu erfðamenginu mun gera rannsakendum kleift að uppgötva sjúkdóma sem koma síðar fram og aðra erfðagalla snemma. Þetta mun gera kleift að taka upplýstari ákvarðanir um lífsstíl, lyfjameðferð og barneignir. Erfðamengjafræði er enn á byrjunarstigi, þó að einn daginn gæti orðið venjubundið að nota raðgreiningu heilla erfðamengja til að skima alla nýbura til að greina erfðafrávik.

Auk sjúkdóma og læknisfræði getur erfðamengjafræði stuðlað að þróun nýrra ensíma sem breyta lífmassa í lífeldsneyti, sem leiðir til meiri uppskeru og eldsneytisframleiðslu, og lægri kostnaðar fyrir neytendur. Þessi þekking ætti að gera kleift að beita betri stjórnunaraðferðum á þær örverur sem iðnaðurinn notar til að framleiða lífeldsneyti. Erfðamengjafræði gæti einnig bætt vöktunaraðferðir sem mæla áhrif mengunarefna á vistkerfi og hjálpað til við að hreinsa upp umhverfismengun. Erfðamengjafræði hefur aðstoðað við þróun landbúnaðarefna og lyfja sem gætu gagnast læknavísindum og landbúnaði.

Það hljómar vel að hafa alla þá þekkingu sem við getum fengið úr raðgreiningu heilla erfðamengja; fólk ber hins vegar ábyrgð á að nota þessa þekkingu af skynsemi. Annars gæti verið auðvelt að misnota mátt slíkrar þekkingar, sem gæti leitt til mismununar á grundvelli erfðaefnis einstaklings, erfðatækni í mönnum og annarra siðferðilegra álitamála. Þessar upplýsingar gætu einnig leitt til lagalegra vandamála varðandi heilsu og friðhelgi einkalífs.