17.1 Líftækni

Hæfniviðmið

Í lok þessa hluta muntu geta gert eftirfarandi:

• Lýst gelrafdrætti
• Útskýrt sameinda- og æxlunareinræktun
• Lýst notkun líftækni í læknisfræði og landbúnaði

Líftækni er notkun líffræðilegra þátta til tæknilegra framfara. Líftækni var notuð við kynbætur búfjár og ræktun nytjaplantna löngu áður en fólk skildi vísindalegan grunn þessara aðferða. Frá því að uppbygging DNA var uppgötvuð árið 1953 hefur líftæknisviðið vaxið hratt bæði með fræðilegum rannsóknum og einkafyrirtæki. Helstu notkunarsvið þessarar tækni eru í læknisfræði (framleiðsla bóluefna og sýklalyfja) og landbúnaði (erfðabreytingar á nytjaplöntum til að auka uppskeru). Líftækni hefur einnig mörg iðnaðarleg notkunarsvið, svo sem gerjun, hreinsun olíuleka og framleiðslu lífeldsneytis (Mynd 17.2).

Grunnaðferðir við meðhöndlun erfðaefnis (DNA og RNA)

Til að skilja grunnaðferðirnar sem notaðar eru við vinnu með kjarnsýrur, skal muna að kjarnsýrur eru stórsameindir gerðar úr kirnum (sykru, fosfati og niturbasa) sem tengd eru saman með fosfódíestertengjum. Fosfathóparnir á þessum sameindum hafa hver um sig nettó neikvæða hleðslu. Heildarsett af DNA-sameindum í kjarnanum kallast erfðamengi. DNA hefur tvo samstæða strengi sem tengdir eru með vetnistengjum milli paraðra basa. Við háan hita (eðlissvipting DNA) geta strengirnir tveir aðskist og kæling getur látið þá parast aftur. DNA-pólýmerasi getur eftirmyndað DNA. Ólíkt DNA, sem er staðsett í kjarna heilkjörnungafrumna, yfirgefa RNA-sameindir kjarnann. Algengasta tegund RNA sem vísindamenn greina er boðbera-RNA (mRNA) vegna þess að það táknar prótínkóðandi genin sem eru virk í tjáningu. Hins vegar fylgja RNA-sameindum aðrar áskoranir við greiningu, þar sem þær eru oft óstöðugri en DNA.

Einangrun DNA og RNA

Til að rannsaka eða meðhöndla kjarnsýrur verður fyrst að einangra eða draga DNA eða RNA úr frumunum. Vísindamenn nota ýmsar aðferðir til að einangra mismunandi gerðir af DNA (Mynd 17.3). Flestar aðferðir við einangrun kjarnsýra fela í sér skref til að brjóta upp frumuna og nota ensímhvörf til að eyðileggja allar stórsameindir sem ekki er óskað eftir (svo sem niðurbrot óæskilegra sameinda og aðskilnað frá DNA-sýninu). Rofjafnalausn (lausn sem er að mestu leyti þvottaefni) brýtur frumur. Athugið að rof merkir „að kljúfa“. Þessi ensím brjóta niður lípíðsameindir í frumuhimnum og kjarnahimnum. Ensím eins og próteasar og ríbónúkleasar (RNasar) brjóta niður prótín og RNA, í þessari röð. Notkun alkóhóls fellur út DNA. Erfðamengis-DNA manna er venjulega sýnilegt sem hlaupkenndur, hvítur massi. Hægt er að geyma DNA-sýnin frosin við –80°C í nokkur ár.

Vísindamenn framkvæma RNA-greiningu til að rannsaka mynstur genatjáningar í frumum. RNA er í eðli sínu mjög óstöðugt vegna þess að RNasar eru algengir í náttúrunni og mjög erfitt að óvirkja þá. Líkt og með DNA, felur einangrun RNA í sér notkun ýmissa jafnalausna og ensíma til að óvirkja stórsameindir og varðveita RNA.

Gelrafdráttur

Vegna þess að kjarnsýrur eru neikvætt hlaðnar jónir við hlutlaust eða basískt sýrustig í vatnsumhverfi, getur rafsvið hreyft þær. Gelrafdráttur er tækni sem vísindamenn nota til að aðskilja sameindir á grundvelli stærðar, með því að nýta þessa hleðslu. Hægt er að aðskilja kjarnsýrurnar sem heila litninga eða búta. Kjarnsýrunum er hlaðið í brunn nálægt neikvæðu rafskauti hálffasta, gljúpa gel-efnisins, og þær dragast að jákvæða rafskautinu á gagnstæðum enda gelsins. Minni sameindir fara hraðar í gegnum holur gelsins en stærri sameindir. Þessi munur á ferðahraða aðskilur bútana á grundvelli stærðar. Til eru staðalsýni fyrir mólþunga sem vísindamenn geta keyrt samhliða sameindunum til að gefa samanburð á stærð. Við getum séð kjarnsýrur í gelefninu með því að nota ýmis flúrljómandi eða lituð litarefni. Aðgreindir kjarnsýrubútar birtast sem bönd í ákveðinni fjarlægð frá toppi gelsins (endanum með neikvæða rafskautinu) á grundvelli stærðar þeirra (Mynd 17.4). Blanda af DNA-bútum úr erfðamengi af mismunandi stærðum birtist sem löng breiða; en óklippt erfðamengis-DNA er venjulega of stórt til að fara í gegnum gelið og myndar eitt stórt band efst í gelinu.

Mögnun kjarnsýrubúta með pólýmerasa-keðjuverkun

Þótt erfðamengis-DNA sé sýnilegt með berum augum þegar það er einangrað í miklu magni, krefst DNA-greining oft þess að einblínt sé á eitt eða fleiri tiltekin svæði erfðamengisins. Pólýmerasa-keðjuverkun (PCR) er tækni sem vísindamenn nota til að magna upp tiltekin DNA-svæði til frekari greiningar (Mynd 17.5). Vísindamenn nota PCR í mörgum tilgangi á rannsóknastofum, svo sem við einræktun genabúta til að greina erfðasjúkdóma, greiningu á aðskota-DNA í sýni og mögnun DNA fyrir raðgreiningu. Hagnýtari notkunarsvið fela í sér faðernispróf og greiningu erfðasjúkdóma.

DNA-búta er einnig hægt að magna upp út frá RNA-móti í ferli sem kallast öfugrita-PCR (RT-PCR). Fyrsta skrefið er að endurskapa upprunalega DNA mótstrenginn (kallað cDNA) með því að bæta DNA kirnum við mRNA. Þetta ferli kallast öfugritun. Þetta krefst tilvistar ensíms sem kallast öfugriti. Eftir að cDNA hefur verið myndað er hægt að nota venjulegt PCR til að magna það upp.

Tengill í námsefni

Dýpkaðu skilning þinn á pólýmerasa-keðjuverkuninni með því að horfa á þetta myndband.

Þreifarapörun, Southern-þrykk og Northern-þrykk

Vísindamenn geta leitað í kjarnsýrusýnum, svo sem bútum úr erfðamengis-DNA og RNA-útdráttum, að tilvist ákveðinna raða. Vísindamenn hanna og merkja stutta DNA-búta, eða þreifara, með geislavirkum eða flúrljómandi litarefnum til að auðvelda greiningu. Rafdráttur aðskilur kjarnsýrubútana eftir stærð þeirra. Vísindamenn færa síðan bútana úr gelinu yfir á nælonhimnu í ferli sem við köllum þrykkun (blotting) (Mynd 17.6). Vísindamenn geta síðan leitað í kjarnsýrubútunum sem eru bundnir við yfirborð himnunnar með sértækum geislavirkum eða flúrljómandi merktum þreifararöðum. Þegar vísindamenn færa DNA yfir á nælonhimnu, kalla þeir tæknina Southern-þrykk. Þegar þeir færa RNA yfir á nælonhimnu, kalla þeir það Northern-þrykk. Vísindamenn nota Southern-þrykk til að greina tilvist ákveðinna DNA-raða í tilteknu erfðamengi, og Northern-þrykk til að greina genatjáningu.

Sameindaklónun

Almennt þýðir orðið „klónun“ sköpun fullkominnar eftirmyndar; í líffræði er endursköpun heillar lífveru hins vegar kölluð „æxlunarklónun“. Löngu áður en reynt var að klóna heila lífveru lærðu vísindamenn hvernig á að fjölfalda æskileg svæði eða búta af erfðamenginu, ferli sem kallast sameindaklónun. Tæknin bauð upp á aðferðir til að búa til ný lyf og sigrast á erfiðleikum með þau sem fyrir voru. Þegar Lydia Villa-Komaroff, sem starfaði í Gilbert-rannsóknarstofunni við Harvard, birti fyrstu greinina sem lýsti tækninni við framleiðslu á tilbúnu insúlíni, fengu sykursýkisrannsakendur og sjúklingar nýja von í baráttunni við sjúkdóminn. Insúlín var á þeim tíma aðeins framleitt úr brisi svína og kúa og lífsnauðsynlega efnið var oft af skornum skammti. Tilbúið insúlín, þegar fjöldaframleiðsla hófst, myndi leysa það vandamál fyrir marga sjúklinga. Þessar fyrstu uppgötvanir leiddu til „líftæknibyltingarinnar“ og hvöttu til áframhaldandi rannsókna og fjármögnunar fyrir nýjar og betri leiðir til að bæta heilsu.

Klónun lítilla erfðamengisbúta gerir vísindamönnum kleift að breyta og rannsaka tiltekin gen (og prótínafurðir þeirra) eða svæði sem ekki kóða, í einangrun. Plasmíð, eða ferja, er lítil hringlaga DNA-sameind sem eftirmyndast óháð litnings-DNA. Við klónun geta vísindamenn notað plasmíðsameindirnar til að búa til „ferju“ til að setja inn æskilegan DNA-bút. Plasmíðum er venjulega komið fyrir í bakteríuhýsli til fjölgunar. Í bakteríusamhenginu kalla vísindamenn DNA-bútinn úr erfðamengi mannsins (eða erfðamengi annarrar rannsakaðrar lífveru) aðkomu-DNA, eða transgen, til að aðgreina það frá DNA bakteríunnar, eða hýsil-DNA.

Raðbrigða DNA-sameindir

Plasmíð með innsettu aðkomu-DNA eru kölluð raðbrigða DNA-sameindir vegna þess að þær eru búnar til á tilbúinn hátt og finnast ekki í náttúrunni. Þær eru einnig kallaðar kímerasameindir vegna þess að uppruna mismunandi hluta sameindanna má rekja til mismunandi tegunda lífvera eða jafnvel til efnafræðilegrar nýmyndunar. Við köllum prótín sem eru tjáð frá raðbrigða DNA-sameindum raðbrigðaprótín. Ekki eru öll raðbrigðaplasmíð fær um að tjá gen. Raðbrigða DNA gæti þurft að flytja í aðra ferju (eða hýsil) sem er betur hönnuð fyrir genatjáningu. Vísindamenn geta einnig breytt plasmíðum til að tjá prótín aðeins þegar ákveðnir umhverfisþættir örva þau, svo þeir geti stjórnað tjáningu raðbrigðaprótínanna.

Sjónræn tenging

Þú ert að vinna á rannsóknarstofu í sameindalíffræði og þér að óvörum skildi samstarfsfélagi þinn aðkomu-DNA úr erfðamengi sem þú ætlar að klóna eftir á rannsóknarborðinu yfir nótt í stað þess að geyma það í frysti. Fyrir vikið brotnaði það niður af völdum kjarnsýruklippa (nucleases), en var samt notað í tilrauninni. Plasmíðið er hins vegar í lagi. Hvaða niðurstöðum myndir þú búast við úr sameindaklónunartilrauninni þinni?

1. Það verða engar þyrpingar á bakteríuskálinni.
2. Það verða eingöngu bláar þyrpingar.
3. Það verða bláar og hvítar þyrpingar.
4. Það verða eingöngu hvítar þyrpingar.

Tengill í námsefni

Skoðaðu hreyfimynd af endurröðun í klónun frá DNA Learning Center.

Frumuklónun

Einfruma lífverur, eins og bakteríur og ger, framleiða náttúrulega klóna af sjálfum sér þegar þær fjölga sér kynlaust með tvískiptingu; þetta er þekkt sem frumuklónun. Kjarna-DNA tvöfaldast með mítósuferlinu, sem skapar nákvæma eftirmynd af erfðaefninu.

Æxlunarklónun

Æxlunarklónun er aðferð sem vísindamenn nota til að klóna eða afrita nákvæmlega heila fjölfruma lífveru. Flestar fjölfruma lífverur fjölga sér með kynæxlun, sem felur í sér erfðablöndun tveggja einstaklinga (foreldra), sem gerir það ómögulegt að búa til nákvæmt afrit eða klón af öðru hvoru foreldrinu. Nýlegar framfarir í líftækni hafa gert það mögulegt að framkalla kynlausa æxlun spendýra á rannsóknarstofu.

Meyfæðing á sér stað þegar fósturvísir vex og þroskast án frjóvgunar eggs. Þetta er form kynlausrar æxlunar. Dæmi um meyfæðingu á sér stað hjá tegundum þar sem kvendýrið verpir eggi og ef eggið er frjóvgað er það tvílitna egg og einstaklingurinn þroskast í kvendýr. Ef eggið er ekki frjóvgað er það áfram einlitna egg og þroskast í karldýr. Ófrjóvgaða eggið er meyfæðingaregg. Sum skordýr og skriðdýr verpa meyfæðingareggjum sem geta þroskast í fullorðin dýr.

Kynæxlun krefst tveggja frumna. Þegar einlitna egg- og sæðisfrumur renna saman verður til tvílitna okfruma. Kjarni okfrumunnar inniheldur erfðaupplýsingarnar til að mynda nýjan einstakling. Hins vegar krefst snemmbúinn fósturþroski umfrymisefnisins sem er í eggfrumunni. Þessi hugmynd myndar grunninn að æxlunarklónun. Þess vegna, ef við skiptum út einlitna kjarna eggfrumunnar fyrir tvílitna kjarna úr frumu hvaða einstaklings sem er af sömu tegund (gjafa), verður hún að okfrumu sem er erfðafræðilega eins og gjafinn. Kjarnaflutningur úr líkamsfrumu (somatic cell nuclear transfer) er tæknin við að flytja tvílitna kjarna í egg sem kjarninn hefur verið fjarlægður úr. Vísindamenn geta notað þetta annaðhvort til lækningaklónunar eða æxlunarklónunar.

Fyrsta klónaða dýrið var Dolly, kind sem fæddist árið 1996. Árangurshlutfall æxlunarklónunar á þeim tíma var mjög lágt. Dolly lifði í sjö ár og dó úr öndunarfærakvillum (Mynd 17.8). Það eru uppi getgátur um að þar sem DNA frumunnar tilheyrir eldri einstaklingi, geti aldur DNA haft áhrif á lífslíkur klónaðs einstaklings. Síðan Dolly kom fram hafa vísindamenn klónað nokkur dýr með góðum árangri, svo sem hesta, naut og geitur, þó að þessi dýr sýni oft frávik í andliti, útlimum og hjarta. Gerðar hafa verið tilraunir til að framleiða klónaða fósturvísa manna sem uppsprettu fósturstofnfrumna í lækningaskyni. Lækningaklónun framleiðir stofnfrumur í tilraun til að lækna alvarlega sjúkdóma eða galla (ólíkt æxlunarklónun, sem miðar að því að fjölfalda lífveru). Þó að sumir hafi mætt tilraunum til lækningaklónunar með mótþróa vegna siðferðislegra sjónarmiða, hafa nýjar uppgötvanir bent á fleiri tækifæri fyrir stofnfrumumeðferðir. Til dæmis uppgötvuðu Freda Miller og Elaine Fuchs, sem störfuðu óháð hvor annarri, stofnfrumur í mismunandi lögum húðarinnar. Þessar frumur hjálpa húðinni að gera við sig sjálf og uppgötvun þeirra gæti haft notagildi við meðferð húðsjúkdóma og hugsanlega annarra kvilla, svo sem taugaskemmda.

Sjónræn tenging

Heldurðu að Dolly hafi verið Finn-Dorset eða Scottish Blackface kind?

Erfðatækni

Erfðatækni er breyting á arfgerð lífveru með því að nota tækni með raðbrigðu DNA til að breyta DNA lífveru til að ná fram eftirsóknarverðum eiginleikum. Viðbót á aðkomu-DNA í formi raðbrigða DNA-ferja sem búnar eru til með sameindaklónun er algengasta aðferð erfðatækni. Lífveran sem tekur við hinu raðbrigða DNA-ið er erfðabreytt lífvera. Ef hið aðkomu-DNA kemur frá annarri tegund hefur hýsillífveran aðkomugen. Vísindamenn hafa erfðabreytt bakteríum, plöntum og dýrum síðan snemma á áttunda áratugnum í fræðilegum, læknisfræðilegum, landbúnaðarlegum og iðnaðarlegum tilgangi. Í Bandaríkjunum eru erfðabreyttar lífverur eins og Roundup Ready sojabaunir og maís sem er ónæmur fyrir kornborum hluti af mörgum algengum unnum matvælum.

Genamiðun

Þó að klassískar aðferðir við að rannsaka virkni gena hafi byrjað með tiltekinni svipgerð og ákvarðað erfðafræðilegan grunn hennar, gerir nútímatækni rannsakendum að byrja á stigi DNA-raðarinnar og spyrja: „Hvað gerir þetta gen eða DNA-þáttur?“ Þessi tækni kallast öfug erfðafræði og snýr klassískri erfðafræðilegri aðferðafræði við. Þessi aðferð væri sambærileg við að skemma líkamshluta til að ákvarða virkni hans. Skordýr sem missir væng getur ekki flogið, sem þýðir að hlutverk vængsins er flug. Klassíska erfðafræðilega aðferðin myndi bera saman skordýr sem geta ekki flogið við skordýr sem geta flogið, og fylgjast með því að ófleygu skordýrin hafa tapað vængjum. Á svipaðan hátt veitir það rannsakendum vísbendingar um virkni gena að stökkbreyta eða eyða genum. Við köllum þær aðferðir sem þeir nota til að óvirkja starfsemi gena sameiginlega genamiðun. Genamiðun er notkun á raðbrigða DNA-ferjum til að breyta tjáningu tiltekins gens, annaðhvort með því að kynna stökkbreytingar í geni, eða með því að útrýma tjáningu ákveðins gens með því að eyða hluta eða allri genaröðinni úr erfðamengi lífverunnar.

Líftækni í læknisfræði og landbúnaði

Auðvelt er að sjá hvernig hægt er að nota líftækni í læknisfræðilegum tilgangi. Þekking á erfðasamsetningu tegundar okkar, erfðafræðilegum grunni arfgengra sjúkdóma og uppfinning tækni til að breyta og laga stökkbreytt gen hefur skapað leiðir til að meðhöndla sjúkdóma. Líftækni í landbúnaði getur aukið viðnám gegn sjúkdómum, meindýrum og umhverfisálagi, og bætt bæði uppskeru og gæði.

Erfðagreining og genalækning

Vísindamenn kalla ferlið við að prófa fyrir grunuðum erfðagöllum áður en meðferð er beitt erfðagreiningu. Eftir erfðamynstri sjúkdómsvaldandi gens er fjölskyldumeðlimum oft ráðlagt að gangast undir erfðapróf. Til dæmis ráðleggja læknar yfirleitt fólki sem greinist með brjóstakrabbamein að fara í vefjasýni svo læknateymið geti ákvarðað erfðafræðilegan grunn krabbameinsþróunarinnar. Læknar byggja meðferðaráætlanir á niðurstöðum erfðaprófa sem ákvarða tegund krabbameins. Ef arfgengar genastökkbreytingar valda krabbameininu ráðleggja læknar einnig öðrum kvenkyns ættingjum að gangast undir erfðapróf og reglubundna skimun fyrir brjóstakrabbameini. Læknar bjóða einnig upp á erfðapróf fyrir fóstur (eða fósturvísa við glasafrjóvgun) til að ákvarða tilvist eða fjarveru sjúkdómsvaldandi gena í fjölskyldum með sértæka lamandi sjúkdóma.

Genalækning er erfðatækniaðferð sem notuð er til að lækna sjúkdóma. Í sinni einföldustu mynd felur hún í sér innleiðingu á heilbrigðu geni á handahófskenndan stað í erfðamenginu til að stuðla að lækningu sjúkdóms sem orsakast af stökkbreyttu geni. Heilbrigða genið er venjulega kynnt inn í sjúkar frumur sem hluti af ferju sem borin er með veiru sem getur sýkt hýsilfrumuna og skilað hinu aðkomu-DNA (Mynd 17.9). Þróaðri form genalækninga reyna að leiðrétta stökkbreytinguna á upprunalega staðnum í erfðamenginu, eins og á við um meðferð á alvarlegum samsettum ónæmisbresti (SCID).

Framleiðsla bóluefna, sýklalyfja og hormóna

Hefðbundnar bólusetningaraðferðir nota veikluð eða óvirk form örvera til að koma af stað upphaflegu ónæmissvari. Nútímaaðferðir nota gen örvera sem eru einræktuð í ferjum til að fjöldaframleiða hið óskaða mótefnavaka. Læknar kynna síðan mótefnavakann í líkamann til að örva frumónæmissvarið og kveikja á ónæmisminni. Læknisfræðin hefur notað gen einræktuð úr inflúensuveirunni til að berjast gegn stöðugt breytilegum stofnum þessarar veiru.

Sýklalyf eru líftækniafurð. Örverur, eins og sveppir, framleiða þau náttúrulega til að ná forskoti á bakteríustofna. Ræktun og meðhöndlun sveppafrumna framleiðir sýklalyf.

Erfðabreytt dýr

Þó að nokkur raðbrigða prótín í læknisfræði séu framleidd með góðum árangri í bakteríum, krefjast sum prótín heilkjörnungadýrs sem hýsils fyrir rétta vinnslu. Af þessum sökum eru hin æskilegu gen einræktuð og tjáð í dýrum, svo sem kindum, geitum, kjúklingum og músum. Dýr sem hefur verið breytt til að tjá raðbrigða DNA kallast dýr með aðkomugen. Nokkur mannleg prótín eru tjáð í mjólk kinda og geita með aðkomugen, og sum eru tjáð í hænueggjum. Vísindamenn hafa notað mýs mikið til að tjá og rannsaka áhrif raðbrigða gena og stökkbreytinga.

Erfðabreyttar plöntur

Að breyta DNA plantna (þ.e. að búa til erfðabreyttar lífverur) hefur hjálpað til við að skapa eftirsóknarverða eiginleika, svo sem viðnám gegn sjúkdómum, þol gegn illgresiseyði og skordýraeitri, betra næringargildi og betra geymsluþol (Mynd 17.10). Plöntur eru mikilvægasta uppspretta fæðu fyrir mannkynið. Bændur þróuðu leiðir til að velja plöntuafbrigði með eftirsóknarverða eiginleika löngu áður en nútíma líftækniaðferðir voru komnar til sögunnar.

Plöntur sem hafa fengið raðbrigða DNA frá öðrum tegundum kallast plöntur með aðkomugen. Vegna þess að þær eru ekki náttúrulegar fylgjast ríkisstofnanir náið með plöntum með aðkomugen og öðrum erfðabreyttum lífverum til að tryggja að þær séu hæfar til manneldis og stofni ekki öðru plöntu- og dýralífi í hættu. Þar sem framandi gen geta dreifst til annarra tegunda í umhverfinu er krafist umfangsmikilla prófana til að tryggja vistfræðilegan stöðugleika. Grunnfæða eins og maís, kartöflur og tómatar voru fyrstu nytjaplönturnar sem vísindamenn erfðabreyttu.

Umbreyting plantna með Agrobacterium tumefaciens

Lífræna skordýraeitrið Bacillus thuringiensis

Flavr Savr tómaturinn

Fyrsta erfðabreytta nytjaplantan á markaði var Flavr Savr tómaturinn árið 1994. Vísindamenn notuðu andskyns-RNA-tækni til að hægja á mýkingar- og rotnunarferlinu sem orsakast af sveppasýkingum, sem leiddi til aukins geymsluþols erfðabreyttu tómatanna. Frekari erfðabreytingar bættu bragð tómatanna. Flavr Savr tómaturinn náði ekki að halda velli á markaði vegna vandamála við meðhöndlun og flutning uppskerunnar.